28 °C-tan 25 eguneko inkubazio estatiko baten ondoren, *Pleurotus ostreatus* NRC620-ren lakasak erakutsi zuen jarduera handiena onddoen hazkuntza-ingurunean. Entzima honetarako pH eta tenperatura balio optimoak 3,0 eta 70 °C izan ziren, hurrenez hurren. 40 °C eta 50 °C-tan 2 orduko inkubazioaren ondoren, entzimaren jarduera % 68,33 eta % 59,61 mantendu zen, hurrenez hurren. Zitrato-fosfato bufferrean (pH 7,0) 2 orduko inkubazioaren ondoren, entzimaren jarduera % 100ean mantendu zen. 10 mM MgSO₄ eta CuSO₄ gehitzeak entzimaren jarduera % 21 eta % 35 inguru handitu zuen, hurrenez hurren, NaCl, MnCl₂, KCl eta CaCl₂-k entzimaren jarduera inhibitzen zuten bitartean. ABTS substratu gisa erabiliz, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakasaren parametro zinetikoak (Km eta Vmax) 1,99 mM eta 16.217 μmol min−1 L−1 izan ziren, hurrenez hurren. Sagar-zuku laginen tratamendu entzimatikoak pHa eta biskositatea nabarmen murriztu zituen, eta murrizketa hori biltegiratze-denboraren igoerarekin korrelazionatu zen. Lakasaren tratamenduak sagar-zukuaren fenol-eduki totala apur bat gutxitzea eragin zuen, baina ez zen antioxidatzaile-jardueraren murrizketarik ikusi.
Azken urteotan, ikertzaileek bioteknologia berdea elikagaien industrian aplikatzen jarri dute arreta. Lakasa elikagaien industriako entzima erabilgarrienetako bat da, eta aplikazioak aurkitzen ditu zukuen prozesamenduan, labean egitean, ardoaren egonkortzean eta elikagaien ezaugarri organoleptikoak hobetzean.1Landare eta mikroorganismo askok lakasa jariatzen dute,2eta deuteromizeto, askomizeto eta basidiomizeto bezalako onddoek ere lakasa sor dezakete.3Lakasa (EC 1.10.3.2) oxidasa urdin bat da, oxigeno molekularra uretara murrizten duena hiru kobre atomo ezberdinez osatutako sistema bat erabiliz, horrela hainbat konposatu fenoliko eta amina aromatiko oxidatuz. Fruta eta barazki zukuen ekoizpenean, marroitze entzimatikoa eta ez-entzimatikoa arazo kritikoak dira.4Substantzia hauek zukuaren kolorean, zaporean eta usainan eragin negatiboa dutenez, kendu egin behar dira.5
Fruta guztien artean, sagarrak dira mundu osoan eta Europar Batasunean gehien kontsumitzen direnak. 2019an, sagar ekoizpena hirugarren postuan sailkatu zen mundu mailan, 87 milioi tona gaindituz.6Sagarrek konposatu fenoliko ugari dituzte, besteak beste, flavonoideak eta azido fenolikoak, hala nola azido kafeikoa eta azido klorogenikoa.7Sagar zukua normalean forma garden batean kontsumitzen denez, osagai fenolikoen % 50etik % 90era galtzen dira iragazketa prozesuan.8Gaur egun, kontsumitzaileek gutxien prozesatutako produktuak aukeratzen dituzte, hala nola polifenol eduki handia duen sagar zuku lainotua. Hala ere, fenol eduki handia duenez, sagar zuku mota hau bereziki sentikorra da kolorez aldatzeko eta iluntzeko.9Hainbat teknologia erabiltzen dira sagar zukua iluntzea murrizteko edo saihesteko, besteak beste, 60-90 °C-ko pasteurizazioa bezalako tratamendu termikoen metodoak.10Hala ere, Sauceda-Gálvezek egindako ikerketaren arabera11, prozesamendu termikoak produktu kimiko lurrunkorrak suntsitu eta sagar zukuaren ezaugarri organoleptikoetan eragina izan dezake. Prozesamendu termikoko metodoen alternatibak hauek dira: karbono dioxido superkritikoa, erradiazio ultramorea, ultrasoinuak, presio hidrostatiko handia edo presio handiko homogeneizazioa.12Teknologia hauen eraginkortasuna eta fruta-zuku egokien etekina erabilitako parametroen eta produktuaren ezaugarrien araberakoak dira. Haien erabilera zabala kostu handiek, elikagai batzuen kalitatean dituzten eragin kaltegarriek edo entzimen inaktibazio desegokiak mugatzen dute.13,14
Lakasa fruta-zukua egonkortzeko eta argitzeko erabil daiteke.15Gökmen eta beste batzuk.16Lakasa erabiltzea gomendatzen dute fruta-zukua argitzeko, konposatu fenolikoak eraginkortasunez kentzen baititu edozein ultrafiltrazio-mintzek erraz kentzen dituen polimero edo oligomero bihurtuz, eta horrek sagar-zukuak kolore eta gardentasun egonkorra mantentzea ahalbidetzen du sei astez 50 °C-tan. *Trichoderma* lakasa purifikatua alumina-aleetan immobilizatu zen eta sagar-zukuaren kutsadura mikrobianoak eragindako zapore desatseginak selektiboki kentzeko erabili zen.17
Sagar zukuaren osagai lurrunkorren % 80-90 inguru esterrak eta aldehidoak dira, eta horiek usain berezia ematen diote zukuari.18*Trametes versicolor*-en lakasa koko-oskol gazteetatik eratorritako zuntz naturalez egindako euskarri merkean immobilizatu zen sagar zukua argitzeko.19Aurreko ikerketek sagar zukuaren egonkortzea (kolorea eta uhertasuna) ikertu dute entzimarik gabeko edo immobilizazio metodoak erabiliz, edo ultrafiltrazioarekin konbinatuta.5,19Hala ere, onddoen lakasek sagar zukuaren propietate fisiko-kimikoetan biltegiratzean duten eragina ez dago argi. Hori dela eta, ikerketa honen helburua sagar zukuaren propietate fisiko-kimikoetan, konposatu fenolikoen edukian eta antioxidatzaileen jardueran izandako aldaketak esperimentalki ikertzea izan zen, onddoen lakasekin tratatu eta bi astez hozkailuan gorde ondoren. Lakasek konposatu fenolikoak oxidatzeko gaitasuna dute, eta horrek hainbat prozesu industrialetan erabiltzeko itxaropentsu bihurtzen ditu, zukua argitzean barne. Ikerketa honek *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasak aztertu zituen, zukua argitzean duten jarduera eta eraginkortasunerako baldintza idealetan arreta jarriz. Ostra perretxikoei (P. ostreatus NRC 620) buruzko ikerketa oraindik mugatua den arren, aurreko ikerketek hainbat onddo-iturritako entzimak aztertu dituzte, hala nola Trametes versicolor eta Ganoderma lucidum. Ikerketa honen helburua entzima honen elikagaien industrian duen aplikazio potentziala ebaluatzea eta bere propietate bereziak nabarmentzea izan zen, batez ere bere pH eta tenperatura idealak.
2,2′-Azooxibis(3-etilbenzotiazolina-6-azido sulfonikoa) (ABTS) Sigma-Aldrich-etik (Kanada) erosi zen. Gainerako erreaktibo guztiak analisi mailakoak ziren.
Ikerketa Zentro Nazionaleko Kultura Mikrobianoen Bilketa Zentroak NRC620 ostra perretxiko andui ezaguna lortu zuen. Azpilaketaren ondoren, andui hau patata dextrosa agar plaketan gorde zen 4 °C-tan. Inokulua prestatzeko metodoa honako hau izan zen: 10 eguneko mizelio guztiz garatua patata dextrosa agar plaketan txertatu eta 28 °C-tan inkubatu zen. 10 egun igaro ondoren, 12 mm-ko diametroko hiru mizelio bloke kendu ziren agar mediotik metalezko zulo esteril bat erabiliz eta 250 ml-ko Erlenmeyer matrazeetan jarri ziren, kotoizko tapoiekin, 50 ml kultura medio esterilizatuarekin (pH 5.0, Othman et al.-ek aurretik deskribatu bezala).20). Kultiboak 28 °C-tan inkubatu ziren 18 egunez. Ondoren, kulturak Whatman 1 zenbakiko iragazki-paperaren bidez iragazi ziren, eta lortutako gainnadantea entzima-iturri gisa erabili zen.
Lakasa jarduera ABTS substratu gisa erabiliz zehaztu zen. Erreakzio-nahasteak (2 mL) 500 μL 0,3 mM ABTS zituen (0,1 M sodio zitrato bufferrean disolbatuta, pH 4,5) eta beharrezko entzima-lagin kantitatea ur destilatuarekin diluituta.21,22Lakasak ABTS oxida dezakeela kontuan hartuta giro-tenperaturan (28 °C ± 2), ABTS oxidazioa zehaztu zen 420 nm-tan xurgapenaren igoera neurtuz (ε420= 36.000 cm-1 M -1) Agilent Carry-100 UV espektrofotometro bat erabiliz. Lakasa jarduera unitate bat behar zen minutuko 1 μmol ABTS oxidatzeko. Proteina kontzentrazioa Bradford metodoaren bidez zehaztu zen, behi-serumeko albumina barne-kontrol gisa erabiliz.23,24
NRC 620 ostra perretxiko anduitik entzima lortu ondoren, bere jarduera neurtu zen hazkuntza-tarte desberdinetan 25 egunez, 28 °C-ko baldintza estatikoetan.
Tenperaturak lakasaren jardueran duen eragina aztertzeko, esperimentuak 20 eta 90 °C arteko tenperatura-tartean egin ziren. Entzima gehitu eta erreakzioa hasi aurretik, bufferra (0,1 M sodio zitratoa, pH 4,5) eta substratua (ABTS) nahastu eta 5 minutuz inkubatu ziren tenperatura desberdinetan. Entzimaren egonkortasun termikoa ebaluatu zen 0,05 M sodio fosfato bufferrean (pH 7,0) 40, 50, 60 eta 70 °C-tan 2 orduz inkubatuz, hurrenez hurren. Ondoren, hondar-jarduera ABTS substratua erabiliz ebaluatu zen.
pH-ak lakasa jardueran duen eragina ebaluatu zen ABTS substratu gisa erabiliz 0,1 M-ko zitrato-fosfato bufferretan, 2,5etik 7,0era bitarteko pH-tartean. Entzima-soluzioa 40 °C-tan inkubatu zen bi orduz 0,1 M-ko zitrato eta Tris bufferretan (pH 3, 4, 6 eta 7) pH-aren egonkortasuna ebaluatzeko. ABTS substratu gisa duen hondar-jarduera kalkulatu zen inkubazioaren ondoren.
Lakasa 10 minutuz inkubatu zen sodio fosfato bufferrean (0,05 M, pH 7,0), hainbat metal ioi (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ eta Mn2+) zituena, 2,5 mM eta 10 mM-ko kontzentrazioetan, hurrenez hurren. Ondoren, substratua (ABTS) gehitu zen erreakzioa hasteko, eta jarduera erlatiboa ebaluatu zen.
ABTS oxidazioa lakasaren bidez hainbat kontzentraziotan (0,025–3 mM) pH 4,5ean neurtu zen parametro zinetikoak (Vmax eta Km) zehazteko. Parametro zinetikoakkonstanteakMichaelis-Menten ekuazioaren balioak Lineweaver-Burk grafiko bat erabiliz kalkulatu ziren, erreakzio-abiaduraren alderantzizkoa substratuaren kontzentrazioaren arabera irudikatzen duena. Konstante zinetikoak Lineweaver-Burk grafikotik kalkulatu ziren, GraphPad Prism 6.01 bertsioa softwarea erabiliz.
Sagarrak txorrotako urarekin ondo garbitu ondoren, erditik moztu eta zukua atera zitzaien Braun MP80 sagar zukugailu automatiko batekin (Alemaniako fabrikatua). Zukua lau gaza-geruzatik iragazi zen. Kontrol-taldeari ez zitzaion entzimarik gehitu, eta % 2,0ko lakasa (probatutako kontzentraziorik eraginkorrena) gehitu zitzaion sagar-zuku freskoari, eta ondoren 4 °C-tan gorde zen bi astez.
Titratzeko moduko azidotasuna (TA) eta pHa Boulton et al.-en metodoaren arabera zehaztu ziren.al.27Lagin bakoitzaren pHa pH neurgailu digital bat erabiliz neurtu zen (JENWAY 3510 pH neurgailua). Titratzeko azidotasuna (TA) azido malikoan oinarrituta kalkulatu zen, formula hau erabiliz.
Non V eta C titrazioan erabilitako sodio hidroxido disoluzioaren bolumena (mL) eta kontzentrazioa (0,1 mol/L) diren, hurrenez hurren. K azido malikoaren bihurketa koefizientea da, 0,067-ren berdina, eta W sagar zukuaren masa (g).
Solido disolbagarri totalak (TDS) zuku lagin guztien edukia PAL-1 poltsikoko errefraktometro bat erabiliz zehaztu zen (ATAGO, Tokio, Japonia). Neurketa bakoitzaren ondoren, lente optikoa ur desionizatuarekin garbitu zen, eta sagar zuku lagin bakoitza hiru aldiz aztertu zen. Lagin bakoitzaren balioa hiru neurketen batez bestekoa eginez kalkulatu zen. Sagar zuku lagin bakoitzaren batez bestekoa ± desbideratze estandarra ere emaitza hauen batez bestekoa eginez kalkulatu zen.
Sagar zuku laginen biskoelastikotasuna biskoszimetro birakari bat erabiliz ebaluatu zen (RV, Rheotest 2, Alemania). Lagina biskoszimetroaren “S2″ zilindroaren barruan jarri zen. Itxurazko biskositatea zizailadura-tentsioaren eta zizailadura-abiaduraren arteko maldaren bidez irudikatu zen, zizailadura-tentsiotik eta dagokien kurbetatik kalkulatua hainbat zizailadura-abiaduratan (1,00etik 437,4 s⁻¹ra). Itxurazko biskositatea kalkulatzeko formula hau da:
Non η biskositate agerikoa (cP) den, τ tentsio mozketa (dyn/cm²), γ tentsio mozketa-abiadura (seg⁻¹) den, eta (τ) momentua (α) eta zilindroaren (Z) balioak erabiliz kalkulatzen den, formula hau erabiliz: τ = Z . α.
Marroitze-indizea Meidav et al.-en metodoaren arabera zehaztu zen.al.2910 ml-ko zuku lagin bat 2750 xg-tan zentrifugatu zen 10 minutuz. Zukuaren gainnadantearen 5 ml % 95eko etanolarekin nahastu ziren. Nahastearen xurgapena 420 nm-tan neurtu zen Shimadzu UV espektrofotometro bat erabiliz (UV-1601 PC).
Fenol eduki osoa (TPC) kolorimetrikoki zehaztu zen Folin-Ciocalteu erreaktiboa erabiliz, Boulton et al.-ek deskribatutako moduan.[27]. Azido galikoaren kurba estandar bat eraiki zen 0 eta 500 mg/L arteko kontzentrazioetarako (r²= 0,997). Emaitzak azido galikoaren baliokide gisa adierazten dira (mg GAE/mL).
Gehitu 125 μL ur destilatu eta 2850 μL FRAP disoluzio 25 μL sagar zukuari eta utzi nahastea iluntasunean.30min. Ondoren, neurtu xurgapena 593 nm-tan Shimadzu UV espektrofotometro bat erabiliz (UV-1601 PC). FRAP erreaktiboa 300 mM azetato bufferra (pH 3.6), 20 mM burdin(III) kloruroa eta 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (40 mM HCl-tan disolbatuta) nahastuz prestatu zen 10:1:1 proportzioan. Kurba estandar bat sortu zen Trolox estandar gisa erabiliz (R²= 0,999), eta emaitzak μM Trolox/mL gisa adierazten dira.
Tratatutako eta tratatu gabeko zukuen antioxidatzaile jarduera DPPH metodoa erabiliz zehaztu zen, DPPH erradikal askeak harrapatzeko duten gaitasuna ebaluatzeko.31Hamar mikrolitro zuku metanolean DPPH disoluzio 1 ml-rekin (100 μM) nahastu ziren. Iluntasunean 30 minutuz erreakzionatu ondoren, nahastearen absortzioa 517 nm-tan neurtu zen Shimadzu UV espektrofotometro bat (UV-1601 PC) erabiliz. Emaitzak trolox baliokide gisa (μM trolox/ml) adierazi ziren, kalibrazio kurba batean oinarrituta (R2= 0,990).
Lortutako datuek erakutsi zuten NRC 620 ostra perretxikoetan lakasa ekoizpen maximoa hartziduraren 18. egunaren amaieran ikusi zela, 1302 U/L-ko jarduera lortuz. Hori izan zen lakasa ekoizpenerako hazkuntza-denbora optimoa zehazteko oinarria (1. irudia). Entzimen ekoizpena hazkuntza-denbora handitu ahala handitu bazen ere, hazkunde-tasa ez zen zuzenean proportzionala hazkuntza-denborarekin; 21 egun igaro ondoren, entzimaren jarduera 90 U/L baino ez zen handitu (1390 U/L-ra). Beraz, azkenean 18 egun hautatu ziren hazkuntza-denbora optimo gisa, produktuaren errendimendua hazkuntza-denbora handitzearen onura ekonomikoekin orekatzeko.
Hazkuntza-denboraren eragina Pleurotus ostreatus NRC 620-n lakasa-errendimenduan. Hiru (12 mm) onddo-mizelio-bloke 50 ml ingurune esterilean txertatu ziren eta ondoren 28 °C-tan landu ziren denbora desberdinetan.
Beste ikerketa batzuekin bat etorriz, gure emaitzek adierazten dute onddoek lakasa jariapen maximoa lortzeko kultura-aldi aproposa 7 eta 36 egun artekoa dela.32Ezike eta beste batzuen arabera.33, *Trametes polyzona* WRF03-k sortu zuen lakasa kopuru handiena hartziduraren bederatzigarren egunaren amaieran, 1637 U/mg proteina-ko jarduera espezifikoarekin. Gainera, Othman et al.34*Trichoderma harzianum* S7113-k lakasa kantitate handia jariatzen zuela aurkitu zuten hazkuntzaren bosgarren egunean. Lakasa ekoizpen-tasak hamalaugarren egunean jo zuen jarduera maximoa eta gero pixkanaka jaitsi zen.34Entzimen jariapena hazkuntza-fase nagusian ere gerta daitekeen arren, normalean tarteko fasean iristen da gailurra eta karbono edo nitrogeno iturri baten kontsumoak eragiten du.34,35
Pleurotus ostreatus NRC 620-ren lakasak jarduera handia erakutsi zuen 50 °C-tik 80 °C-ra bitarteko tenperatura-tarte zabal batean, jarduera maximora hurbilduz (% 69-98), bere jarduera maximoa 70 °C-tan ikusi zen (2a irudia). Tenperatura-tarte honetatik kanpo, entzimaren jarduera gutxitu egin zen 70 °C inguruan. Emaitza hauek iradokitzen dute entzima aktiboa dela tenperatura altuetan, ziurrenik tenperatura altuak erreakzioaren energia zinetikoa handitzen duelako.
Erreakzio-tenperaturaren (a) eta pH-aren (b) eragina lakasa-jardueran *Pleurotus ostreatus* NRC 620-n. 20 eta 90 °C arteko tenperaturak lortu ziren nahastea tenperatura desberdinetan 5 minutuz aldez aurretik inkubatuz, entzima gehitu eta erreakzioa hasi aurretik. pH-ak lakasa-jardueran duen eragina ebaluatu zen ABTS substratu gisa erabiliz, 0,1 M zitrato-fosfato bufferra duten disoluzioetan, 2,5 eta 7,0 arteko pH tarte batean.
Ezike eta beste batzuen araberaal.33, *Trametes polyzona* WRF03 lakasaren tenperatura optimoa 55 °C da, *Ganoderma lucidum*-en berdina.laccase36eta *Trametes polyzona* KU-RNW02737-rako tenperatura optimoaren (50 °C) antzekoalakasa . Baldrian38ohartarazten du, lignina degradatzen duten beste entzima-sistemetan bezala, lakasarentzat tenperatura-tarte aproposa 50 eta 70 °C artekoa dela.
Emaitzek erakutsi zuten entzimak jarduera handiena 3.0 pH-an erakutsi zuela, % 94ko jarduerara iritsiz pH 3.5ean. Hala ere, aktibo mantendu zen 2.5etik 7.0era bitarteko pH tarte zabal batean (2b irudia). Gainera, jarduera handiagoa erakutsi zuen baldintza azidoetan baldintza neutro edo alkalinoekin alderatuta. Bere jarduera gutxienez % 77koa mantendu zen 2.5etik 4.5era bitarteko pH tartean, baina % 38 ingurura baino ez zen iritsi pH 7.0ean. *Trametes polyzona* WRF03-ren lakasaren pH optimoa 4.533 izan zen, *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 eta *Trametes hirsuta* 41-ren lakasen pH berdina. Hala ere, Chairin et al.-en ikerketaren arabera...42, *Polymorpha f. sp.* WR710-1-en lakasaren pH optimoa 2,2 da, eta *Polymorpha f. sp.* IBL-04-en lakasaren pH optimoa, berriz, 5,043 da. Hidroxido anioien (lakasa inhibitzailea) T2/T3 lakasaren kobre atomoei lotzea izan daiteke lakasaren jarduera gutxitzearen arrazoia pH neutro edo alkalinoko baldintzetan. Horrek T1 zentrotik T2/T3 zentrorako barne elektroien transferentzia eten dezake, horrelamugatzaileaentzimaren jarduera23,44
Entzima tenperatura desberdinetan inkubatuz, ikusi zen bai inkubazio denborak bai tenperaturak eragina zutela entzimaren egonkortasunean. Aipagarria da *Trametes polyzona* NRC 620-ren lakasak egonkortasun handiagoa erakutsi zuela 40℃ eta 50℃-tan, hasierako jardueraren % 68,33 eta % 59,61 mantenduz, hurrenez hurren, 120 minutu igaro ondoren (3a irudia). Aldiz, baldintza berdinetan (40℃ eta 50℃, 120 minutu), *Trametes polyzona* WRF03-ren lakasak bere jardueraren % 64,38 eta % 42,92 mantendu zuen, hurrenez hurren.33Aitzitik, inkubazio denbora eta tenperatura handitzeak *Trametes polyzona* NRC 620 lakasaren egonkortasuna gutxitu zuen; 60 ℃ eta 70 ℃-tan 60 minutuz inkubatu ondoren, bere jarduera % 39,24ra eta % 1,72ra jaitsi zen, hurrenez hurren (3a irudia). Emaitza esperimentalekin bat etorriz, *Trametes polyzona* WRF03-ren lakasak egonkortasun handiagoa erakutsi zuen 40 eta 50 ℃-tan tratamendu termiko prozesu osoan zehar.33Era berean, Lueangjaroenkit eta beste batzukal.37eta Chairin eta beste batzukal.42Trametes polyzona KURNW027 eta Trametes polyzona WR710-1-en lakasen egonkortasuna jakinarazi zuten 50 °C-tan ordubetez, hurrenez hurren. Hainbat bioteknologia-arlotan aplika daitekeen biokatalizatzaile erabilgarri gisa, lakasak egonkortasun eta errendimendu ona izan beharko luke tenperatura-tarte zabal batean.
*Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasaren egonkortasun termostatikoa (a) eta pH-egonkortasuna (b). Egonkortasun termostatikoa entzima-soluzioa 0,05 M-ko sodio fosfato bufferrean (pH 7,0) 40, 50, 60 eta 70 °C-tan 2 orduz inkubatuz ebaluatu zen, hurrenez hurren. pH-egonkortasuna entzima-soluzioa 0,1 M-ko zitrato bufferrean eta Tris bufferrean (pH 3, 4, 6 eta 7) 40 °C-tan 2 orduz inkubatuz ebaluatu zen. Hondar-jarduera ABTS substratu gisa erabiliz kalkulatu zen inkubazioaren ondoren.
Entzimen erabilera eta biltegiratze baldintza optimoak zehazteko, pH-ak lakasaren egonkortasunean duen eragina ikertu genuen. pH balio desberdinen eraginpean egoteak proteina egituraren egonkortasunean eragin nabarmena izan zuen, eta horrela, entzima molekularen egonkortasunean eta jardueran eragina izan zuen. Emaitzek erakutsi zuten entzima ez zela hain egonkorra baldintza azidoetan, baina pH balio altuagoetan (eskualde neutroak eta alkalinoak) egonkortasun hobea erakutsi zuen. 7,0, 6,0, 4,0 eta 3,0 pH balioetan, entzimaren atxikipen tasak 120 minutu igaro ondoren % 100, % 62,54, % 52,39 eta % 11,14 ingurukoak izan ziren, hurrenez hurren (3b irudia). *Strombus multisus* WRF03 lakasak egonkortasun handiagoa erakutsi zuen pH balio neutroetan (5,5–6,5) eta egonkortasun txikiagoa pH balio azidoetan (4,0 azpitik). 5,5, 6,0 eta 6,5eko pH-balioetan 120 minutu eman ondoren, entzimen atxikipen-tasak % 82, % 100 eta % 93 ingurukoak izan ziren, hurrenez hurren.33Khairin eta beste batzuk.42adierazi zuen Trametes polyzona WR710-1-eko lakasa egonkorra zela 6,0 eta 7,0 arteko pH tartean, eta Sayed et al.-ek, berriz,45erakutsi zuen lakasa egonkorragoa zela pH neutroko baldintzetan. Hala ere, Cerrena unicolor-eko lakasak ere egonkortasuna erakutsi zuen baldintza alkalinoetan (pH 9.0).46Aztertutako lakasek egonkortasun handia erakutsi zuten pH tarte zabal batean. Baliteke hau ezaugarri garrantzitsua izatea industria-aplikazioetarako.
Metal ioi batzuek entzimen jardueran efektu estimulatzaileak eta inhibitzaileak dituztenez, entzimen jardueran duten eragina kontuan hartu behar da industria-aplikazioetan. Hau funtsezkoa da, metal ioiak ingurumen-kutsatzaile ohikoak baitira eta zelulaz kanpoko entzimen egonkortasunean eta sintesian eragina izan dezaketenak.47*Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasan ioi metaliko anitzek dituzten efektuak ikertzeko, dagokion esperimentua egin genuen. 4. irudian erakusten den bezala, erabilitako metal motaren arabera, ioi metalikoen kontzentrazioa 2,5 mM-tik 10 mM-ra handitzeak entzimaren funtzioan eragin negatiboa izan zuen. Adibidez,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, etaCu²⁺entzimen jarduera estimulatu eta aktibatu dezake, aldi bereanNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, etaK⁺entzimaren jarduera inhibitzeko gai izan zen. 10 mM-ko kontzentrazioan, Cu²⁺ eta Mg²⁺ ioiak izan ziren *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasa jardueraren aktibatzaile indartsuenak, % 34 eta % 20 inguruko aktibazio-maila emanez, hurrenez hurren. Hala ere, 10 mM-ko kontzentrazioan, Ca²⁺ ioiak izan ziren lakasaren inhibitzaile indartsuenak, entzimaren jarduera % 60 inguru murriztuz.
Metal ioien eragina Pleurotus ostreatus NRC 620 lakasaren jardueran. Lakasa 10 minutuz inkubatu zen sodio fosfato bufferrean (0,05 M, pH 7,0), 2,5 mM eta 10 mM-ko kontzentrazioetan hainbat metal ioi zituela. Ondoren, erreakzioa substratua (ABTS) gehituz hasi zen, eta ondoren jarduera erlatiboa neurtu zen.
Gure emaitzak beste egile batzuekin bat datoz, Mg²⁺ eta Cu²⁺-k *Trametes polyzona* WRF03³-ren jarduera areagotzen dutela aurkitu baitzuten. Castaño et al.⁴⁸-k aurkitu zuten *Xylaria* sp.-ren lakasa neurri batean kobre ioiek (Cu²⁺) estimulatzen dutela. Gainera, Foroutanfar et al.⁴⁹ eta Si et al.⁵⁰-k antzeko ikerketak egin zituzten *Paraconiothyrium variabile* eta *Trametes pubescens*-en lakasekin, hurrenez hurren. Entzima honen II motako kobre lotura-gunea (T2) Cu²⁺-rekin saturatu daiteke kontzentrazio jakin batean, eta horrek azal lezake lakasaren jardueraren estimulazioa Cu²⁺³⁹ kontzentrazio handiagoetan. Usteltze zuriaren onddoen lakasak kobrezko atomo anitz dituzten oxidasak direnez, kobrezko ioien efektuak lakasa jardueran anitzak dira eta estimulatzaile eta inhibitzaileetatik neutroetaraino doaz.⁵¹ Aldiz, Zhou et al.[52]jakinarazi zuenezCu²⁺Taiwango lurpeko termitaren (Odontotermes formosanus) lakasa jarduera inhibitzen zuen. Hala ere, Cerena sp. HYB07-ren lakasak[53]eta Clitocybe maxima[54]ez ziren kobre ioien eraginpean egon.
Substratuaren espezifikotasuna parametro zinetikoen bidez irudikatu zen (Km eta Vmax); substratuak entzimarekiko lotura-afinitate handiagoa izan, orduan eta txikiagoa zen Km balioa eta handiagoa zen substratuaren espezifikotasuna.3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasaren parametro zinetikoak (Km eta Vmax) GraphPad Prism 6.0 softwarea erabiliz zehaztu ziren, Lineweaver-Burk grafikoa marraztuz (5. irudia). ABTS substratu gisa erabiltzean, emaitzak 1,99 mM eta 16217 μmol izan ziren.min⁻¹ L⁻¹,hurrenez hurren. Elsayed et al.21ABTS oxidazioaren Km balioak 0,1 mM eta 0,064 mM zirela jakinarazi zuen, hurrenez hurren, Lac A eta Lac B isoentzimen ABTSrekiko afinitate handia adieraziz. Gainera, Vmax balioak 0,182 μmol izan ziren.min⁻¹eta 0,603 μmolmin⁻¹, hurrenez hurren. Lortutako Km balioa Trametes polyzona WRF03-rena (8,66 mM) baino txikiagoa izan zen; gainera, haien Vmax balioa (1429 mmol min⁻¹) erebeheagoABTS substratu gisa erabiltzean.33 Era berean, Lentinus squarrosulus MR13 eta Trametes sp. AH28-2 lakasa kontzentrazioak 0,0714 mM eta 0,025 mM izan ziren, hurrenez hurren, eta Vmax balioak 0,0091 mM min−1 eta 0,67 mM min−1 mg−1 izan ziren (ABTS-rekiko)., hurrenez hurren.56,57
ABTS kontzentrazioak *Pleurotus ostreatus* NRC 620-ren lakasaren jardueran duen eragina ikertu zen, eta hasierako erreakzio-abiaduraren alderantzizkoaren eta ABTS kontzentrazioaren arteko Lineweaver-Burk grafiko bat marraztu zen. ABTS-ren oxidazio-erreakzioa lakasaren kontzentrazio desberdinekin (0,025–3,0 mM) neurtu zen 4,5eko pH-an parametro zinetikoak (Vmax eta Km) zehazteko. Michaelis-Menten konstante zinetikoak erreakzio-abiaduraren eta substratuaren kontzentrazioaren arteko Lineweaver-Burk grafikoa erabiliz kalkulatu ziren. Konstante zinetikoak Lineweaver-Burk grafikotik kalkulatu ziren GraphPad Prism 6.01 softwarea erabiliz.
Pektinasak bezalako argitze-entzima tradizionalek substantzia pektikoak hidrolizatzen dituzte, biskositatea eta uhertasuna murriztuz. Polisakarido estrukturalak eraginkortasunez apurtzen dituzte eta askotan beste entzima batzuekin konbinatuta erabiltzen dira, hala nola zelulasekin eta hemizelulasekin, etekina eta gardentasuna hobetzeko. Hala ere, pektinasak ez dituzte konposatu fenolikoak bereziki helburu, eta hauek dira uhertasunaren eta marroi oxidatiboaren eragile nagusiak, batez ere sagar eta mahats zukua bezalako zukuetan.58Aitzitik, lakasek konposatu fenolikoen oxidazioa katalizatzen dute, molekula handiago eta disolbaezinetan polimerizatuz, sedimentazio edo iragazketa bidez kendu daitezkeenak. Mekanismo honek ez du gardentasuna hobetzen bakarrik, baita zukuaren iraupena luzatzen ere, konposatu fenolikoek eragindako marroi oxidatiboaren probabilitatea murriztuz. Gainera, lakasetan oinarritutako argitze-prozesuak prozesatzeko baldintza leunetan egin daitezke (pH 3,5–5,5, tenperatura 25–40 °C), eta horrek zuku delikatuetarako egokiak bihurtzen ditu, haien propietate nutrizionalak edo organoleptikoak arriskuan jarri gabe.59Ikerketek erakutsi dute pektinasa tratamenduak zukua 1-2 ordutan argitu dezakeela, lakasa tratamenduak, berriz, erreakzio-denbora luzeagoa behar duela (3-6 ordu) konposatu fenolikoak guztiz murrizteko. Hala ere, prozesu hau optimiza daiteke entzima immobilizatuz edo lakasa argitze-metodo mekanikoekin konbinatuz.60Ikerketa honetan, erauzkin gordinaren entzima-profilak lakasa eta α-amilasa jarduera esanguratsuak erakutsi zituen, pektinasa eta xilanasa jarduerak oso baxuak ziren bitartean, eta zelulosa jarduera ez zen detektatu. Beraz, uhertasun eta fenol edukiaren murrizketa batez ere lakasaren ekintzaren ondoriozkoa izan zen, eta biskositatearen aldaketa, berriz, neurri batean amilasaren ekintzaren ondoriozkoa izan liteke.
1. taulan sagar zuku freskoaren eta lakasaz tratatutako laginen parametro fisiko-kimikoak ageri dira. Emaitzek erakutsi zuten sagar zuku freskoaren etekina (% 71,59) lakasaz tratatutako laginena (% 87,34) baino txikiagoa zela. Emaitza hauek Pilnik eta Orange-ren aurkikuntzekin bat datoz.61, zeinak adierazi zuen fruta-prozesamenduan entzimen erabilerak zukuaren etekina handitu dezakeela, iragazketa hobetu eta kontzentraziorako kalitate handiko zuku garbia lor dezakeela. Zukuaren etekinaren igoera batez ere zukuan dauden azukre disolbagarrien edukiaren igoeraren ondorioz gertatzen da. Fruituen hidrolisi entzimatikoan, produktuaren zelula-hormetako mesoglea eta pektina suntsitzen dira eta substantzia disolbagarri bihurtzen dira, hala nola azukre eta azido neutroetan.62.Entzimekin tratatutako sagar zukuaren pH balioa kontrol taldearena baino nabarmen txikiagoa izan zen (P < 0,05), eta bi taldeen pH balioa nabarmen handitu zen biltegiratzean zehar (1. taula). Emaitza hauek Mark et al.-enekin bat datoz.63, zeinak adierazi zuen anakardo-zukuaren pHa jaitsi egiten zela biltegiratze-tratamendu termikoaren ondoren. Pektinaren degradazioa eta azido galakturonikoaren eraketa entzima-tratamenduaren ondoren izan daitezke biltegiratzean zeharreko pH-aren igoeraren erantzule. Entzima-tratatutako laginen pHa 4,05 eta 4,31 artean mantendu zen biltegiratze osoan, eta tratatu gabeko sagar-zukuaren pHa, berriz, 4,12 eta 4,33 artean egon zen.
Tratatu gabeko eta lakasaz tratatutako laginen azidotasun totalak (TA) beheranzko joera erakutsi zuen biltegiratze denbora handitu ahala (1. taula). Azidotasunaren jaitsiera azido organikoak karbohidrato bihurtzeari edo erreakzio entzimatikoei egotzi zitzaion, baita zukua biltegiratzean zehar oxidatzeari ere.64Kontrol-sagar zukuaren eta entzima-tratatutako laginen azidotasun osoa beste zukuena baino txikiagoa zen (marrubi zukua % 0,9, aran zukua % 2,2, kumquat zukua % 1,0, abricot zukua % 2,4, laranja zukua % 0,8), baina beste zukuena antzekoa (adibidez, udare zukua % 0,3).62Sagar zuku fresko tratatu gabearen desberdintasun hauek hainbat faktoreren ondorio izan daitezke, hala nola hazkuntza-baldintzen, faktore genetikoen, heldutasun-mailaren eta prozesatzeko metodoen ondorioz.65Kontrol-sagar-zukuaren eta lakasaz tratatutako sagar-zukuaren azidotasun totalaren jaitsiera Singh et al.-ek aurkeztutako emaitzekin bat dator.66Jin Nuo sagar zukuaren azidotasun totalaren jaitsierari buruz, 74 eguneko biltegiratzearen ondoren. Bestalde, Oshmiansky eta Wojdylo67ez zuen sagar zukuaren azidotasunean aldaketa esanguratsurik aurkitu argitzeko metodo tradizionalen eragina aztertzerakoan.
1. taulan aurkeztutako emaitzek adierazten dute lakasaz tratatutako sagar zukuaren solido disolbagarri guztien (TSS) balioa tratatu gabeko laginarena baino handiagoa zela. Emaitza hauek argitaratutako ikerketekin bat datoz.. 68Gainera, 1. taulak erakusten du kontrol sagar zuku taldearen TSS balioa 9,58 zela hasierako unean eta 11,05era iritsi zela biltegiratze-aldiaren amaieran. Balio hauek Hamid et al.-ek jakinarazitako sagar zuku freskoaren TSS balioak baino txikiagoak dira.. 69(11,2 eta 11,80, hurrenez hurren). Lakasaz tratatutako sagar zuku laginen TSS balioa nabarmen handitu zen, 11,23tik hasi eta 12,93ra iritsiz bi astez 4 °C-tan biltegiratu ondoren (1. taula). Biltegiratzean TSS-ren antzeko igoera ikusi zen zitrikoetan, limoietan eta laranja gozoetan ere. Biltegiratzean solido disolbagarri guztien (TSS) igoera polisakaridoen (almidoia) monosakaridoetara (azukre) hidrolisiaren, zukua deshidratatzeagatik kontzentrazioaren igoeraren eta zukuko pektina solido disolbagarrietara degradazioaren ondorio izan daiteke. Solido disolbagarri guztien (TSS) igoera azukre disolbagarrien igoeraren ondorio da ziurrenik, eta azukre horiek pektina edo zelulosa azukre disolbagarrietara bihurtzeagatik sor daitezke, pektina edo zelulosa erabiliz, hurrenez hurren, edo almidoia azukreetara hidrolisiagatik, Hamed et al.-ek jakinarazi zuten bezala.69.Lakasak sagar zukuaren propietateetan duen eragina bisualki ikus daiteke, lakasarekin tratatutako sagar zukuak tratatu gabeko zukuak baino jariakortasun hobea eta biskositate txikiagoa erakusten baitu. Behaketa hau 1. taulan jasota dago; Entzimarekin tratatutako laginaren biskositatea 1,87 cP-koa izan zen, eta kontrol laginarena, berriz, 2,95 cP-koa. Biskositatearen jaitsiera nabarmen hau pektina-antzeko substantziek ura atxikitzeko duten gaitasun handiagoaren eta sare-egitura kohesionatu baten eraketaren ondorio da ziurrenik.
Ikerketa honetan, lakasak sagar zukuaren marroitze-indizean (BI) duen eragina ikertu da, espektrofotometro bat erabiliz 420 nm-tan xurgapena neurtuz. Emaitzak 1. taulan ageri dira. Biltegiratzean, sagar zuku laginen BIak, bai tratatutako taldeetan bai tratatu gabekoetan, pixkanaka handitzen joan da. BIak marroitze-maila islatzen du eta balio dezake...garrantzitsu batmarroitze-erreakzio entzimatiko eta ez-entzimatikoen adierazle. Xurgapena nabarmen handitu zen biltegiratzean zehar (P < 0,05). Biltegiratzearen amaieran,A420Kontrol-taldeetan eta entzima-tratamenduko taldeetan sagar-zuku laginen balioa % 217 eta % 121 inguru handitu zen, hurrenez hurren (1. taula). Emaitzek adierazten dute entzima-tratamenduak marroitze-maila % 56 inguru murriztu dezakeela. Bezerra et al.-en emaitzek[19] gure emaitzekin bat datoz; Lakasa-glutaraldehido-koko-zuntza erabili zuten sagar zukua argitzeko, jatorrizko kolorea % 61 murriztuz.
Fruta-zukuetako polifenolek eragin nutrizional eta terapeutiko positiboak badituzte ere giza gorputzean, proteinekin ere erreakziona dezakete, zukua lainotu, sedimentatu edo uhertu egin dadin, eta horrela produktuaren zaporea eta usaina aldatuz eta iraupena murriztuz.71Ikerketa honen helburua sagar-zukuaren konposatu fenolikoen edukia segurtasunez murriztea izan zen, Pleurotus ostreatus NRC 620-tik eratorritako lakasa erabiliz. 1. taulan aurkeztutako emaitzek erakusten dute lakasarekin tratatutako sagar-zukuaren konposatu fenolikoen eduki osoa nabarmen murriztu zela 4 °C-tan gorde aurretik. Gainera, konposatu fenolikoen eduki osoa ere gutxitu egin zen biltegiratzean aztertutako bi laginetan (1. taula). Sandri et al.-ek egindako ikerketa.72erakutsi zuen entzimekin tratatutako sagar zukuak bere antioxidatzaile jarduera eta konposatu fenolikoen edukia mantentzen dituela. Hala ere, Lettera et al.-ek egindako ikerketa baten emaitzek.73erakusten dute laranja zukua onddoen lakasarekin tratatzeak bertan dauden konposatu fenolikoen edukia % 45eraino murriztu dezakeela.
Konposatu fenolikoek propietate hauek dituztela frogatu da: erradikal askeak harrapatzeko, oxigeno singletearen murrizketa eta itzaltzea, hidrogeno atomoen transferentzia eta elektroien dohaintza erradikal askeei, eta horrek antioxidatzaile indartsu bihurtzen ditu.74Beraz, ikerketa honetan, DPPH eta FRAP oinarritutako metodoak erabili ziren lakasak hozkailuan 14 egunez gordetako sagar zukuaren jarduera antioxidatzailean duen eragina ebaluatzeko (2. taula). Bi metodoek jarduera antioxidatzailearen igoera erakutsi zuten biltegiratzean, eta hori konposatu fenoliko askeen igoeraren edo Maillard erreakzio produktuen (MRP) eraketaren ondorioz izan daiteke, Maillard erreakzio produktuak izanik jarduera antioxidatzailearen igoeraren arrazoia.75Entzimatikoki ez diren marroitze-erreakzioek (azido askorbikoaren degradazioa, Maillard erreakzioak eta azukreen azido-katalizatutako degradazioa barne) pigmentu marroiak (melanoidinak) sortzen dituzte. Tarteko azido askorbikoaren degradazio-produktuek eta azukreen degradazio-produktuek (karbonilo konposatuak, adibidez) aminoazidoekin erreakziona dezakete Maillard erreakzioen bidez.76Fruta eta barazkien biltegiratzean marroitzea sakonki aztertu den arren, erreakzio horien ulermena mugatua da oraindik.77FRAP metodoarekin alderatuta, lakasaz tratatutako sagar zukuak nabarmen txikiagoa izan zen antioxidatzaile jarduera DPPH metodoaren bidez (2. taula), eta lagin guztien antioxidatzaile jarduera nabarmen handitu zen biltegiratze denbora handitu ahala. Bi metodo desberdin erabili ziren ikerketa honetan antioxidatzaile jarduera zehazteko, haien printzipioak desberdinak direlako. DPPH metodoak erradikal askeak neutralizatzeko gaitasuna neurtzen du, eta FRAP metodoak, berriz, burdin ioiak murrizteko gaitasuna. Hori dela eta, gomendagarria da antioxidatzaile jarduera zehazteko hainbat metodo erabiltzea aztertutako laginen antioxidatzaile jarduera hobeto ulertzeko.78
Ikerketa honen aurkikuntza nagusietako bat da *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakasak jarduera optimoa erakusten duela 70 °C-tan eta pH 3.0-an. Zukuak argitzeko erabili ohi diren beste onddo-lakasekin alderatuta, hala nola *Trametes versicolor* eta *Ganoderma lucidum* lakasekin, *P. ostreatus* NRC 620-k egonkortasun termiko handiagoa eta pH azidoagoa erakusten ditu. *Trametes versicolor* eta *Ganoderma lucidum*-en lakasek normalean jarduera optimoa erakusten dute 50-60 °C-ko tartean eta 3,5 eta 5,0 arteko pH balioetan. Desberdintasun honek zukua argitzeko eraginkortasuna hobetzen lagun dezake, batez ere zuku azidoetan, non pH balio baxuagoetan egonkortasuna funtsezkoa den. *P.-ren ezaugarri berezia. Aztertutako beste onddo-lakasekin alderatuta, *Pleurotus ostreatus* NRC 620-k baldintza zailagoetan eraginkortasunez funtzionatzeko gaitasuna erakusten du. Bere jarduera-tenperatura optimo altuagoak abantaila potentzialak iradokitzen ditu industria-aplikazioetan, hala nola erreakzio-abiadura azkarragoak eta kutsadura mikrobiano txikiagoa. Bere pH baxua, zuku askoren izaera azidoarentzat oso egokia dena, erabilgarria izan daiteke zukua argitzeko prozesuetan. Emaitza hauek eskala handiko aplikazioetarako ikerketa gehiago justifikatzen dituzte, eta horrek *Pleurotus ostreatus* NRC 620 onddoen lakasa iturri tradizionalen alternatiba bideragarri bihurtzen du. Aurreko ikerketekin alderatuta, ikusi dugu tenperatura optimoa 60 °C dela eta pH optimoa 3,0 dela. 60 °C-tan 80 minutuz erreakzionatu ondoren, *Ganoderma lucidum* lakasa mantendu zen.46Bere jardueraren %.79 Kurniawati eta Nicelleren arabera80*Ganoderma lucidum* entzimek egonkortasun bikaina edo moderatua erakusten dute 25 °C-tan eta 5,0 eta 8,0 bitarteko pH balioetan, eta egonkortasuna pH 6,0-tan eta 10 eta 30 °C bitarteko tenperaturetan. Ikerketa honetan, ikusi genuen *Pleurotus ostreatus*-en entzimaren jarduerarako pH eta tenperatura optimoak 3,0 eta 70 °C zirela, hurrenez hurren. 40 °C eta 50 °C-tan bi orduz inkubatu ondoren, entzimak bere jardueraren % 68,33 eta % 59,61 mantendu zuen, hurrenez hurren. Gainera, Pleurotus ostreatus NRC 620 lakasak jarduera handia erakutsi zuen 50 °C eta 80 °C arteko tenperatura tarte zabal batean, ia jarduera maximoa lortuz (% 69-% 98), jarduera maximoa 70 °C-tan ikusi zelarik.
Ondorioz, baldintza estatikoetan lortutako NRC620 ostra perretxiko lakasak jarduera eta egonkortasun optimoa erakutsi zuen pH eta tenperatura baldintza sorta batean, beste entzima iturri batzuekin alderatuta egonkortasun handiagoa erakutsiz. 10 mM MgSO₄ eta CuSO₄ gehitzeak entzimaren jarduera % 21 eta % 35 handitu zuen gutxi gorabehera, hurrenez hurren. Sagar zukuan prozesatzean, entzimak pHa eta biskositatea murriztu zituen, eta fenol edukia apur bat bakarrik jaitsi zen biltegiratzean.
Emaitzek lakasaren potentziala berresten dute elikagaien industrian, batez ere edarien argitzean. Konposatu fenolikoak espezifikoki deskonposatuz, lakasak ez du soilik uhertasuna murrizten eta gardentasuna hobetzen, baita zukuen kalitatea mantentzen ere funtzionamendu-baldintza leunetan. Gelatina, bentonita eta silize-gela bezalako argitzeko agente tradizionalen aldean, lakasak ez du hondakinik sortzen edo edarietatik usain atseginik kentzen, eta horrek aukera ingurumena errespetatzen duena eta iraunkorragoa bihurtzen du. Gainera, beste entzima eta iragazketa-metodo batzuekin alderatuta, lakasak irtenbide zuzendu eta kostu-eraginkorra eskaintzen du produktuaren kalitatea arriskuan jarri gabe.
Kyomuhimbo, HD eta Brink, HG. Kobrea duten lakasen aplikazioak eta immobilizazio estrategiak; berrikuspena. Heliyon 9, e13156 (2023).
Argitaratze data: 2025eko abenduaren 15a